Em 1868, durante o período final da Revolução Industrial, com a Irmandade dos Assassinos erradicada, os gémeos Jacob (Paul Amos) e Evie Frye (Victoria Atkin)[17] deixam Crawley e dirigem-se para Londres. Ao chegarem encontram uma cidade controlada pelos Templários, em que tanto a Igreja como a Monarquia estão a perder o poder. Criados como Assassinos para seguirem os ensinamentos da Irmandade, Jacob e Evie querem restabelecer a ordem retirando o controlo feito por Crawford Starrick, um terrível Templário industrialista,[18][19] e infiltrando-se no mundo do crime organizado de Londres.[6][2][3][5][10][20] Em adição, são apresentadas durante a história as "anomalias temporais". Ao acedê-las o jogador é levado para outras épocas da história de Londres.[21]  Jacob e Evie irão cruzar-se com várias figuras notáveis como o médico John Elliotson,[22] os cientistas David Brewster[23] e Richard Owen, os políticos Benjamin Disraeli[24] e Edward Hodson Bayley, o tenente-general James Thomas Brudenell, o inspector Frederick Abberline,[18] o escritor Charles Dickens, o naturalista Charles Darwin, o inventor Alexander Graham Bell, o teórico de economia e política Karl Marx, a pioneira da enfermagem moderna Florence Nightingale e a Rainha Victoria.[25]